فیلتر فلورسانس یک جزء ضروری در میکروسکوپ فلورسانس است.یک سیستم معمولی دارای سه فیلتر اصلی است: یک فیلتر تحریک، یک فیلتر انتشار و یک آینه دو رنگ.آنها معمولاً در یک مکعب بسته بندی می شوند تا گروه با هم در میکروسکوپ قرار گیرند.
فیلتر فلورسانس چگونه کار می کند؟
فیلتر تحریک
فیلترهای تحریک نور با طول موج خاصی را منتقل می کنند و طول موج های دیگر را مسدود می کنند.می توان از آنها برای تولید رنگ های مختلف با تنظیم فیلتر استفاده کرد تا فقط یک رنگ از آن عبور کند.فیلترهای تحریک در دو نوع اصلی وجود دارند - فیلترهای گذر طولانی و فیلترهای باند گذر.محرک معمولاً یک فیلتر باندگذر است که فقط طول موج های جذب شده توسط فلوروفور را عبور می دهد، بنابراین تحریک سایر منابع فلورسانس را به حداقل می رساند و نور تحریک را در باند انتشار فلورسانس مسدود می کند.همانطور که با خط آبی در شکل نشان داده شده است، BP 460-495 است، به این معنی که فقط می تواند از فلورسانس 460-495 نانومتر عبور کند.
در مسیر روشنایی یک میکروسکوپ فلورسانس قرار می گیرد و تمام طول موج های منبع نور به جز محدوده تحریک فلوروفور را فیلتر می کند.حداقل انتقال فیلتر، روشنایی و درخشندگی تصاویر را تعیین می کند.حداقل انتقال 40٪ برای هر فیلتر تحریک توصیه می شود به طوری که انتقال در حالت ایده آل بیش از 85٪ باشد.پهنای باند فیلتر تحریک باید کاملاً در محدوده تحریک فلوروفور باشد به طوری که طول موج مرکزی (CWL) فیلتر تا حد امکان نزدیک به اوج طول موج تحریک فلوروفور باشد.چگالی نوری فیلتر تحریک (OD) تاریکی تصویر پس زمینه را دیکته می کند.OD معیاری است که نشان می دهد فیلتر چقدر طول موج های خارج از محدوده انتقال یا پهنای باند را مسدود می کند.حداقل OD 3.0 توصیه می شود اما OD 6.0 یا بیشتر ایده آل است.
فیلتر انتشار
فیلترهای انتشار به منظور اجازه دادن فلورسانس مطلوب از نمونه به آشکارساز عمل می کنند.آنها طول موج های کوتاه تر را مسدود می کنند و برای طول موج های طولانی تر انتقال بالایی دارند.نوع فیلتر همچنین با یک عدد همراه است، به عنوان مثال BA510IF در شکل (فیلتر مانع تداخل)، که تعیین به طول موج در 50٪ حداکثر انتقال آن اشاره دارد.
همان توصیه ها برای فیلترهای تحریک برای فیلترهای انتشار صادق است: حداقل انتقال، پهنای باند، OD و CWL.یک فیلتر انتشار با ترکیب ایده آل CWL، انتقال حداقل و OD روشن ترین تصاویر ممکن را با عمیق ترین مسدود کردن ممکن ارائه می دهد و تشخیص ضعیف ترین سیگنال های انتشار را تضمین می کند.
آینه دو رنگ
آینه دو رنگی بین فیلتر تحریک و فیلتر انتشار با زاویه 45 درجه قرار می گیرد و سیگنال تحریک را به سمت فلوروفور منعکس می کند در حالی که سیگنال انتشار را به آشکارساز منتقل می کند.فیلترهای دو رنگ ایدهآل و تقسیمکنندههای پرتو دارای انتقالهای واضحی بین حداکثر بازتاب و حداکثر انتقال هستند، با بازتاب بیش از 95 درصد برای پهنای باند فیلتر تحریک و انتقال بیش از 90 درصد برای پهنای باند فیلتر انتشار.فیلتر را با در نظر گرفتن طول موج تقاطع (λ) فلوروفور انتخاب کنید تا نور سرگردان را به حداقل برسانید و نسبت سیگنال به نویز تصویر فلورسنت را به حداکثر برسانید.
آینه دو رنگی در این شکل DM505 است، به این دلیل که 505 نانومتر طول موج 50 درصد حداکثر انتقال برای این آینه است.منحنی انتقال برای این آینه انتقال بالا در بالای 505 نانومتر، افت شدید انتقال به سمت چپ 505 نانومتر و حداکثر بازتابش در سمت چپ 505 نانومتر را نشان میدهد، اما همچنان ممکن است مقداری انتقال کمتر از 505 نانومتر داشته باشد.
تفاوت بین فیلترهای گذر طولانی و باند گذر چیست؟
فیلترهای فلورسانس را می توان به دو نوع تقسیم کرد: گذر طولانی (LP) و باند گذر (BP).
فیلترهای گذر بلند، طول موج های بلند را انتقال می دهند و موج های کوتاه تر را مسدود می کنند.طول موج قطع، مقدار 50 درصد انتقال پیک است و تمام طول موج های بالای برش توسط فیلترهای گذر بلند منتقل می شود.آنها اغلب در آینه های دو رنگ و فیلترهای انتشار استفاده می شوند.فیلترهای Longpass باید زمانی استفاده شوند که کاربرد به حداکثر جمعآوری انتشار نیاز دارد و زمانی که تمایز طیفی مطلوب یا ضروری نیست، که معمولاً برای کاوشگرهایی که یک گونه گسیلکننده منفرد را در نمونههایی با سطوح نسبتاً پایین خودفلورسانس پسزمینه تولید میکنند، صادق است.
فیلترهای باند گذر فقط یک باند طول موج مشخص را منتقل می کنند و بقیه را مسدود می کنند.آنها با اجازه دادن تنها به قوی ترین بخش از طیف انتشار فلوروفور برای انتقال، تداخل را کاهش می دهند، نویز فلورسانس خودکار را کاهش می دهند و بنابراین نسبت سیگنال به نویز را در نمونه های خودکار فلورسانس پس زمینه بالا، که فیلترهای گذر طولانی نمی توانند ارائه دهند، بهبود می بخشند.
چند نوع مجموعه فیلتر فلورسانس BestScope می تواند عرضه کند؟
برخی از انواع رایج فیلترها عبارتند از فیلترهای آبی، سبز و فرابنفش.همانطور که در جدول نشان داده شده است.
مجموعه فیلتر | فیلتر تحریک | آینه دو رنگ | فیلتر مانع | طول موج لامپ LED | کاربرد |
B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485 نانومتر | ·FITC: روش آنتی بادی فلورسنت · پرتقال اسیدی: DNA، RNA ·اورامین: باسیل سل ·EGFP، S657، RSGFP |
G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535 نانومتر | · رودامین، TRITC: روش آنتی بادی فلورسنت · پروپیدیوم یدید: DNA · RFP |
U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365 نانومتر | · مشاهده خودکار فلورسانس ·DAPI: رنگ آمیزی DNA · Hoechest 332528, 33342: برای رنگ آمیزی کروموزوم استفاده می شود |
V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405 نانومتر | · کاتکول آمین ها · 5-هیدروکسی تریپتامین · تتراسایکلین: اسکلت، دندان |
R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640 نانومتر | · Cy5 · الکسا فلور ۶۳۳، الکسا فلور ۶۴۷ |
مجموعههای فیلتری که در اکتسابهای فلورسانس استفاده میشوند، حول طول موجهای اصلی مورد استفاده در کاربردهای فلورسانس طراحی شدهاند که بر اساس پرمصرفترین فلوروفورها است.به همین دلیل، آنها همچنین بر اساس فلوروفوری که برای تصویربرداری در نظر گرفته شده اند، نامگذاری شده اند، مانند مکعب های فیلتر DAPI (آبی)، FITC (سبز) یا TRITC (قرمز).
مجموعه فیلتر | فیلتر تحریک | آینه دو رنگ | فیلتر مانع | طول موج لامپ LED |
FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485 نانومتر |
DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365 نانومتر |
TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535 نانومتر |
FL-Auramine | BP470 | DM480 | BA485 | 450 نانومتر |
تگزاس قرمز | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560 نانومتر |
mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560 نانومتر |
چگونه فیلتر فلورسانس را انتخاب می کنید؟
1. اصل انتخاب فیلتر فلورسانس این است که اجازه دهید نور فلورسانس/گسیل تا آنجا که ممکن است از انتهای تصویر عبور کند و همزمان نور تحریک را کاملاً مسدود کند تا بالاترین نسبت سیگنال به نویز به دست آید.به خصوص برای استفاده از تحریک چند فوتونی و میکروسکوپ بازتاب داخلی کل، نویز ضعیف نیز تداخل زیادی در اثر تصویربرداری ایجاد می کند، بنابراین نیاز به نسبت سیگنال به نویز بیشتر است.
2. طیف تحریک و انتشار فلوروفور را بشناسید.برای ساخت یک مجموعه فیلتر فلورسانس که تصویری با کیفیت بالا و کنتراست بالا با پسزمینه سیاه ایجاد میکند، فیلترهای تحریک و انتشار باید به انتقال بالایی با حداقل موجهای باند عبور بر روی مناطقی که با پیکها یا انتشارات تحریک فلوروفور مطابقت دارند، دست یابند.
3. دوام فیلترهای فلورسانس را در نظر بگیرید.این فیلترها باید در برابر منابع نور شدیدی که نور ماوراء بنفش (UV) تولید میکنند که میتواند منجر به فرسودگی شود، نفوذناپذیر باشد، بهویژه فیلتر محرک که در معرض شدت کامل منبع روشنایی قرار میگیرد.
تصاویر نمونه فلورسنت مختلف
منابع در اینترنت جمع آوری و سازماندهی می شوند و فقط برای یادگیری و ارتباط استفاده می شوند.در صورت وجود هرگونه تخلف، لطفاً برای حذف با ما تماس بگیرید.
زمان ارسال: دسامبر-09-2022